IGF-1 LR3 liofilizuotas,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95 proc.). Tačiau ilgalaikis naudojimas Didelės dozės gali sukelti hipoglikemiją, todėl reikia stebėti gliukozės kiekį kraujyje.
Pateikiame ne tik grynus miltelius ir kapsules, bet ir kitas dozavimo formas. Jei reikia, susisiekite su mūsų pardavimo komanda.
Mūsų gaminiai iš
IGF-1 LR3 COA
Genų klonavimas ir ekspresijos vektoriaus konstravimas
Genų dizainasIGF-1 LR3 liofilizuotasyra pagrįsta natūralaus IGF-1 seka, tačiau su šiais pagrindiniais pakeitimais:
N-galo plėtinys: pridėkite 13 aminorūgščių (MFPAMPLSSLFFN) prie IGF-1 N-galo, kad pailgintumėte jo pusinės eliminacijos laiką ir padidintumėte jo biologinį aktyvumą.
Aminorūgščių pakeitimas: glutamo rūgštį (Glu) 3 IGF-1 padėtyje pakeiskite argininu (Arg), ty R3 modifikacija, kad sumažėtų gebėjimas prisijungti prie IGFBP ir padidėtų laisvoji koncentracija.
genų sintezė
Gaukite tikslinio geno fragmentą cheminės sintezės arba PGR amplifikacijos būdu, remiantis sukurta IGF-1 LR3 geno seka. Cheminėje sintezėje paprastai taikoma kietosios fazės sintezės technologija, palaipsniui pridedant nukleotidų ir galiausiai sintezuojant pilnus genų fragmentus. PGR amplifikacija naudoja žinomas IGF-1 sekas, kad sukurtų pradmenis ir amplifikuotų tikslinį geną per PGR reakciją.
Tinkamo ekspresijos vektoriaus pasirinkimas yra esminis baltymų ekspresijos žingsnis. Dažniausiai naudojami ekspresijos vektoriai apima pET serijas (pvz., pET30a), pGEX serijas ir kt. Šie vektoriai turi efektyvius promotorius, kelias klonavimo vietas ir žymų sekas (pvz., His žymes), kurios palengvina vėlesnį baltymų gryninimą ir aptikimą.
Pavyzdžiui, ekspresijos vektoriaus pET30a konstravimo etapai yra tokie:
Fermentinis skilimas: naudokite restrikcijos endonukleazes, tokias kaip BamHI ir XhoI, kad atliktumėte dvigubą fermentinį pET32a vektoriaus ir IGF-1 LR3 geno fragmento skilimą, kad gautumėte papildomus lipnius galus.
Ryšys: fermentu suardytas vektorius ir geno fragmentas yra sujungti T4 DNR ligaze, kad susidarytų rekombinantinis ekspresijos vektorius pET32a-LR3-IGF1.
Transformacija: paverskite rekombinantinį ekspresijos vektorių į kompetentingas E. coli ląsteles (tokias kaip DH5) ir gaukite teigiamus klonus per antibiotikų atranką (pvz., ampiciliną).
Identifikavimas: patvirtinkite rekombinantinio ekspresijos vektoriaus teisingumą tokiais metodais kaip kolonijų PGR, fermentų virškinimo identifikavimas arba sekos nustatymas.
Baltymų ekspresija
Ekspresijos kamienų parinkimas
Baltymų ekspresijai labai svarbu pasirinkti tinkamą ekspresijos padermę. Dažniausiai naudojamos ekspresijos padermės yra Rosetta (DE3), BL21 (DE3) ir kt. Šios padermės turi efektyvias T7 RNR polimerazės sistemas ir gali efektyviai ekspresuoti genus, kuriuos varo T7 promotorius.
Kaip pavyzdį paėmus Rosetta (DE3), jos charakteristikos yra šios: turi T7 RNR polimerazės geną, sukeltą IPTG ekspresijos. Retų kodono tRNR genų nešiojimas gali efektyviai ekspresuoti egzogeninius genus, kuriuose yra retų kodonų. Tinka ekspresuoti toksiškus baltymus arba sunkiai ekspresuojamus baltymus.
Išraiškos sąlygų optimizavimas
Baltymų ekspresijos sąlygos, tokios kaip induktoriaus koncentracija, indukcijos temperatūra, indukcijos laikas ir kt., turi didelę įtaką baltymų išeigai ir kokybei. Optimizavus ekspresijos sąlygas, IGF-1 LR3 ekspresijos lygis gali būti padidintas.
Indukuojančio agento koncentracija: IPTG yra dažniausiai naudojamas indukuojantis agentas, kurio koncentracija paprastai yra 0,1–1 mM. Atlikdami gradiento eksperimentus nustatykite optimalią IPTG koncentraciją, kad pasiektumėte aukščiausią baltymų ekspresijos lygį.
Indukcinė temperatūra: Indukcinė temperatūra paprastai parenkama tarp 16-37 laipsnių. Žemesnė temperatūra (pvz., 16–20 laipsnių) gali padėti sumažinti baltymų skilimą ir inkliuzinio kūno formavimąsi bei padidinti tirpių baltymų išeigą.
Indukcijos laikas: Indukcijos laikas paprastai yra nuo 2 iki 24 valandų, o optimalus indukcijos laikas nustatomas analizuojant baltymų ekspresijos lygius per tam tikrą mėginių ėmimą.
Baltymų ekspresijos aptikimas
IšraiškaIGF-1 LR3 liofilizuotasbuvo aptiktas SDS{0}}PAGE ir Western blot metodais.
SDS-PUSLAPIS: surinkite bakterijų mėginius prieš ir po indukcijos, atlikite ultragarsinį fragmentavimą arba cheminę lizę, centrifuguokite, kad atskirtumėte supernatantą ir nuosėdas, ir atskirai atlikite SDS-PAGE analizę. Lyginant baltymų juostų pokyčius supernatante ir nuosėdose prieš ir po indukcijos, buvo patvirtinta IGF-1 LR3 ekspresija.
Western blot: naudokite specifinius antikūnus (pvz., anti-His tag antikūnus arba anti-IGF-1 antikūnus), kad atliktumėte SDS-PAGE atskirtų baltymų imunoblotinę analizę, kad dar labiau patvirtintumėte IGF-1 LR3 ekspresiją ir molekulinę masę.
Baltymų valymas
Bakterijų lizė
Surinkite sukeltas bakterijų ląsteles ir jas lizuokite, kad išsiskirtų tarpląsteliniai baltymai. Įprasti krekingo metodai apima ultragarsinį suskaidymą, homogenizavimą aukštu-slėgiu, cheminį krekingą ir kt. Kaip pavyzdį pateikiame ultragarsinį suskaidymą, veiksmai yra tokie:
Bakterijų surinkimas: Centrifuguokite sukeltą ekspresijos bakterijų tirpalą, kad surinktumėte bakterijų ląsteles, ir resuspenduokite jas lizės buferyje (pvz., PBS arba Tris HCl buferyje).
Ultragarsinis suskaidymas: bakterijų suspensija dedama į ledo vonią ir susmulkinama naudojant ultragarsinį ardiklį, paprastai taikant trumpalaikį daugkartinį suskaidymo metodą (pvz., 10 sekundžių kiekvieną kartą, 10 sekundžių intervalas, kartojama 10 kartų), kad būtų išvengta baltymų denatūravimo dėl perkaitimo.
Išcentrinis atskyrimas: Centrifuguokite susmulkintą bakterijų suspensiją, kad atskirtumėte supernatantą ir nuosėdas. Supernatante yra tirpių baltymų, o nuosėdose gali būti inkliuzinių kūnų arba ląstelių liekanų.
Afininė chromatografija
Dėl to, kad rekombinantinis IGF-1 LR3 paprastai turi His žymę, jį galima išvalyti naudojant nikelio jonų afininę chromatografiją (Ni NTA).
Kolonėlės paruošimas: Į chromatografijos kolonėlę įdėkite Ni NTA užpildą ir subalansuokite jį pusiausvyros buferiu (pvz., PBS, kuriame yra 20 mM imidazolo).
Mėginio įkėlimas: Į chromatografijos kolonėlę įpilkite bakterijų lizato supernatantą, kad IGF-1 LR3 su His žyma susijungtų su nikelio jonais.
Plovimas: išplaukite chromatografijos kolonėlę plovimo buferiu (pvz., PBS, turinčiu 50 mM imidazolo), kad pašalintumėte nesurištus arba silpnai surištus priemaišų baltymus.
Eliuavimas: Naudokite eliuavimo buferį (pvz., PBS, kuriame yra 250 mM imidazolo), kad išplautumėte IGF-1 LR3, prijungtą prie chromatografijos kolonėlės, ir surinkite eliuentą.
Gėlinimas ir koncentravimas
IGF-1 LR3 tirpale po eliuavimo yra didelė imidazolo koncentracija, kurią reikia pašalinti gėlinant ir koncentruojant, kad padidėtų baltymų koncentracija.
Geldinimas: naudokite gėlinimo kolonėlę arba dializės maišelį, kad pašalintumėte imidazolą iš eliuento ir pakeistumėte jį tinkamu buferiniu tirpalu (pvz., PBS).
Koncentracija: koncentruokite nudruskintą baltymų tirpalą naudodami ultrafiltravimo mėgintuvėlius arba išcentrinius koncentratorius, kad padidintumėte baltymų koncentraciją iki norimo lygio.
Grynumo ir aktyvumo tikrinimas
Išgryninto IGF-1 LR3 grynumas ir aktyvumas buvo aptiktas SDS-PAGE, HPLC arba ELISA metodais.
SDS-PUSLAPIS: išanalizuokite išgryninto baltymo grynumą ir įsitikinkite, kad nėra akivaizdžių priemaišų juostų.
HPLC: naudokite atvirkštinės fazės HPLC arba dydžio išskyrimo HPLC, kad toliau analizuotumėte baltymų grynumą ir molekulinės masės pasiskirstymą.
ELISA: IGF-1 LR3 biologiniam aktyvumui nustatyti naudojamas su fermentais susietas imunosorbento tyrimas (ELISA), o jo aktyvumo lygį atspindi prisijungimo prie specifinių antikūnų laipsnis.
Džiovinimo šalčiu procesas
Džiovinimo šalčiu principas
Liofilizavimas yra džiovinimo technika, kuri pašalina drėgmę žemoje{0}}temperatūros šaldymo ir vakuuminės sublimacijos būdu. Džiovinimo šalčiu- procesą sudaro trys etapai: išankstinis užšaldymas, džiovinimas sublimaciniu būdu ir džiovinimas desorbciniu būdu, kuris gali padidinti baltymo aktyvumą ir stabilumą.
Džiovinimo šalčiu žingsniai
Padalinkite išgrynintą IGF-1 LR3 tirpalą į šaldymo džiovinimo butelius arba penicilino butelius ir įdėkite juos į šaldymo džiovintuvą, kad iš anksto užšaltų žemiau -40 laipsnių, kad tirpalas visiškai užšaltų.
Palaipsniui pakelkite temperatūrą iki maždaug -20 laipsnių vakuumo sąlygomis, kad ledas sublimuotų tiesiai į vandens garus ir pašalintų didžiąją dalį drėgmės. Šiame etape būtina kontroliuoti kaitinimo greitį ir vakuumo laipsnį, kad būtų išvengta baltymų denatūravimo ar žlugimo.
Toliau pakelkite temperatūrą iki 20-30 laipsnių, kad pašalintumėte likutinę drėgmę ir sumažintumėte liofilizuoto produkto drėgmės kiekį iki mažiau nei 1%. Šiame etape būtina palaikyti aukštą vakuumo laipsnį, kad būtų užtikrintas visiškas drėgmės pašalinimas.
Baigę džiovinti, greitai uždarykite šaldymo{0}}džiovinimo buteliuką arba penicilino buteliuką, kad į jį nepatektų drėgmė.
Apsauga nuo šalčio džiūvimo
Norint apsaugoti IGF-1 LR3 aktyvumą ir stabilumą džiovinant šalčiu-, paprastai reikia pridėti apsaugos nuo šalčio-džiūvimo. Įprastos apsaugos nuo šalčio džiovinimo priemonės yra:
- Angliavandeniai: tokie kaip alginatas, sacharozė, gliukozė ir kt., gali sudaryti stiklines struktūras ir stabilizuoti baltymų konformaciją.
- Polimerai, tokie kaip polietilenglikolis (PEG) ir polivinilpirolidonas (PVP), gali padidinti tirpalų klampumą ir sumažinti baltymų agregaciją.
- Aminorūgštys, tokios kaip glicinas ir alaninas, gali veikti kaip vandenilio jungčių donorai arba akceptoriai, stabilizuoti baltymų struktūrą.
- Paviršinio aktyvumo medžiagos, tokios kaip Tween 20, Tween 80 ir kt., gali sumažinti baltymų adsorbciją ant talpyklos sienelių ir pagerinti regeneravimo greitį.
Kaip pavyzdį imant trehalozę, jos pridedamas kiekis paprastai yra 1-10 kartų didesnis už baltymų masę, kuri džiovinant užšaldant gali sudaryti apsauginį sluoksnį, kad būtų išvengta baltymų denatūravimo.
Džiovinimo šalčiu proceso optimizavimas
Džiovinimo šalčiu{0}}proceso optimizavimas yra labai svarbus gerinant kokybęIGF-1 LR3 liofilizuotas. Reguliuojant tokius parametrus kaip priešužšaldymo temperatūra, džiovinimo sublimacijos temperatūra, analitinė džiovinimo temperatūra ir vakuuminis laipsnis, galima pasiekti geriausią džiovinimo šaldant{1} efektą.
Temperatūra prieš užšalimą
Kad tirpalas visiškai užšaltų, išankstinė užšaldymo temperatūra turi būti žemesnė už eutektinį baltymo tašką. Paprastai pasirenkama žemesnė nei -40 laipsnių temperatūra.
Sublimacinio džiovinimo temperatūra
Sublimacijos džiovinimo temperatūra turi būti žemesnė už baltymo žlugimo temperatūrą, kad būtų išvengta baltymų denatūravimo arba talpyklos žlugimo. Dažniausiai pasirenkama apie -20 laipsnių.
Džiovinimo temperatūros analizė
Analizės džiovinimo temperatūra turi būti aukštesnė už sublimacijos džiovinimo temperatūrą, kad būtų pašalinta likutinė drėgmė. Paprastai pasirenkamas 20-30 laipsnių.
Vakuuminis laipsnis
Vakuuminis laipsnis turi būti palaikomas žemame lygyje (pvz<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
Populiarus Žymos: igf-1 lr3 liofilizuotas, Kinijos igf-1 lr3 liofilizuotas gamintojai, tiekėjai
